Študijsko vprašanje: Kako magnetno aktivirano celično razvrščanje (MACS) neapaptotičnih spermijev spremeni profil metilacije DNK spermijev v primerjavi s spermiji, pripravljenimi samo s centrifugiranjem z gradientom (DGC)? Povzetek odgovora: Sekveniranje DNA z metodo RRBS je odkrilo 99 različno metiliranih regij (DMR) in 800 različno metiliranih pozicij (DMP) med MACS selekcioniranimi spermiji in spermiji, ki se jih je pripravilo samo z DGC metodo. Kaj je že znano : Postopek MACS omogoča izbiro neapptotskih spermijev z izboljšano kakovostjo, zlasti v smislu fragmentacije DNK. Študije so pokazale, da lahko uporaba takšnih spermijev v postopkih ICSI / IVF izboljša stopnjo oploditve, kakovost zarodkov / blastocist (zlasti pri ženskah, starejših od 30 let) in stopnjo nosečnosti. Kljub znanemu pozitivnemu učinku na selekcijo spermijev z nižjo fragmentacijo DNK drugi vplivi MACS na genetski / epigenetski status sperme niso znani. Epigenetski status (zlasti metilacija) postaja v zadnjem času pomemben predmet zanimanja, saj se je pokazalo, da se tudi epigenetske informacije lahko prenašajo transgeneracijsko, ne da bi se pri tem spremenilo zaporednje DNK. Oblika študije, velikost, trajanje: Naša prospektivna študija je vključevala 19 parov, ki so se leta 2018 zdravili s postopkom ICSI zaradi moške neplodnosti, natančneje zaradi teratozoospermije (definirane po strogih Krugerjevih merilih). Ženske v paru, vključenih v raziskavo, niso bile starejše od 36 let in morale so imeti vsaj 6 zrelih MII jajčnih celic po nadzorovani hiperstimulaciji jajčnikov. Polovica MII jajčnih celic je bila oplojena z uporabo spermijev, pripravljenega samo z DGC metodo, in polovica s spermiji pripravljenimi z MACS metodo. Udeleženci / gradiva, nastavitev, metode: MACS smo izvedli po DGC z uporabo sistema MACS® ART Annexin V (Miltenyi). Preostali spermiji, ki niso bili uporabljeni za ICSI, so bili ocenjeni glede na morfologijo, fragmentacijo DNA (HaloSperm) in shranjeni v tekočem dušiku za analizo metilacije z RRBS. Za odkrivanje različno metiliranih regij (DMR) in pozicij (DMP) med vzorci DGC in MACS sta bila uporabljena dvodimenzionalni test Kolmogorov-Smirnov (za DMR) in Mann-Whitney U test (za DMP). Glavni rezultati: Od vseh shranjenih vzorcev so bili za analizo RRBS uporabljeni vzorci 7 pacientov, od tegajih je bilo 5 uspešno analiziranih. Primerjava spermijev, selekcioniranih z MACS metodo, in spermijev pripravljenih samo za DGC, je pokazala, da je odstotek morfološko normalnih spermijev (14,0 ± 10,8 v primerjavi z 13,2 ± 10,0; P = 0,335) in spermijev s fragmentirano DNK (39,4 ± 14,8 v primerjavi z 47,3 ± 22,8; P = 0,183) med skupinama podobni, čeprav sta oba indeksa fragmentacije DNK nenormalna. Stopnja oploditve in kakovost zarodkov se ni bistveno razlikovala, čeprav je v skupini z MACS obstajal trend višje stopnje razvoja do blastociste (25,0% v primerjavi z 52,6%; P = 0,097). Analiza RRBS je identificirala 99 DMR in 800 DMP. 43 DMR in 392 DMP je bilo hipermetilirano v skupini DGC, 56 DMR in 408 DMP pa hipometiliranih. Ko so bili DMR-jem pripisani geni, jih je 8,8% bilo pripisanih promotorjem, 11,8% eksonom, 33,0% intronom in 46,4 intergenskim regijam. V primeru DMP jih je bilo 5,3% označenih za promotorje, 5,4% za eksone, 39,3% za introne in ostalo za intergene regije. Ko se je pregledalo kam na Cp-je so uvrščeni DMR-ji, jih je bilo na CpG otočke pripisanih 16,1%, na CpG shores 6,5% in CpG shelves 5,0%, medtem ko je bilo pri DMP 5,3% pripisanih CpG otočkom, 18,0% CpG shores in 7,1% hCpG shelves. Omejitve, razlogi za previdnost: Zaradi protamina je DNK v spermijih močno kondenziran, kar otežuje analizo RRBS in lahko negativno vpliva na kakovost dobljenih podatkov o zaporedju. Za potrditev dobljenih rezultatov je treba analizirati večje število vzorcev. Širše posledice ugotovitev: Profil metilacije DNK spermijev se lahko uporabi kot dodaten test za oceno kakovosti spermijev. Lahko bi se ga tudi povezalo s kakovostjo zarodkov / blastocist in bi
COBISS.SI-ID: 6618540
Namen-ozadje: Epigenetske spremembe so normalne in so nujne, da lahko celice z istim genetskim zaporedjem opravljajo različne naloge v tkivih in organih. Toda nedavni napredek epigenetskih raziskav kaže na to, da se lahko tudi epigenetske informacije prenašajo preko spolnim celic in te informacije preidejo v naslednje generacije. Ker lahko na epigenetske spremembe vplivajo okolje, življenjski slog (npr. kajenje), starost ali celo zdravila, se poraja vprašanje, ali bi lahko podobno vplivali tudi postopki oploditve z biomedicinsko pomočjo. Zaradi tega smo se odločili za preiskovanje sprememb v metilaciji DNA spermijev. Že prej so nekatere študije nakazovale, da se lahko vzorec metilacije DNK spermijev poveže s kakovostjo spermijev, vendar ni zaenkrat še nič znanega, kako lahko metode priprave semena vplivajo na vzorec metilacije DNA spermijev. Zato smo preverili, kakšen je vzorec metilacije DNA spermijev centrifugiranju semena z gradientom (DGC) v primerjavi z DGC, ki mu je sledilo magnetno aktivirano celično razvrščanje (MACS). Material in metode: Analizirali smo seme pacientov, ki so bili vključeni program zdravljenja neplodnosti na naši kliniki. Polovica semena je bila pripravljena za ICSI po metodi DGC, druga polovica pa z DGC, ki ji je sledil MACS (MACS® ART Annexin V System, Miltenyi). Po izvedbi ICSI postopka (z uporabo pristopa oploditve sestrih jajčnih celic) smo preostale vzorce obdelali za analizo metilacije DNA. Metilacija DNA celotnega genoma spermijev je bila določena z uporabo sekveniranja z metodo RRBS (reducirano reprezentativno bisulfitno sekveniranje). Za odkrivanje pomembno metiliranih položajev smo uporabili Mann-Whitneyjev test. P vrednosti pod 0,05 so bile prepoznane kot statistično pomembne. Rezultati: Analiza je pokazala 800 različno metiliranih pozicij, od katerih je bilo 392 hipermetiliranih in 408 hipometiliranih v vzorcih DGC v primerjavi z vzorci DGC + MACS. Med hipermetiliranimi pozicijami je bilo več takih, ki so bili prej povezane z reprodukcijo / neplodnostjo, na primer najbolj zanimivi geni, na katerih se te pozicije nahajajo, so IGF2, UBE2W, ISG15, HIF3A, NOTCH1, FOXD1, CD24. Podobna je bilo ugotovljeno tudi za hipometilirane položaje, kjer so se različno metilirana pozicije nahajale na genih PRDM16, ILF2, IFNGR2, FOXL1, AGTPBP1, GPM6A, PDGFA. Ugotovljeno je bilo tudi več drugih različno metiliranih pozicij, ki so se nahajale na genih, povezanih z zdravstvenimi težavami, kot so GNB1, PTDSS2, CDH12, NEUROG1 in BCAP31. Zaključki: Naša raziskava je pokazala, da lahko na vzorec metilacije DNA spermijev vpliva metoda priprave semena. Zanimivo pa je, da je bilo nekaj različno metiliranega pozicij pripisano genom, pomembnim za reprodukcijo / neplodnost, in celo genom, ki so bili povezani z zdravstvenimi težavami. Omejitev študije je majhno število vključenih bolnikov (5). Za potrditev ugotovitev študije je treba vključiti več bolnikov.
COBISS.SI-ID: 6621612
Ozadje Vzorci metilacije DNK se lahko dedujejo transgeneracijsko in nanje vplivajo življenjski slog in okoljski dejavniki. Bilo je predalgano, da se ti vzorci spremenijo lahko spremenijo zaradi postopkov zunajtelesne oploditve. Cilji Oceniti vpliv dveh različnih načinov priprave sperme, običajnega centrifugiranja z gradientom (DGC) v primerjavi s centrifugiranjem z gradientom, ki mu sledi magnetno aktivirano celično razvrščanje (MACS) ne-aptoptičnih spermijev, na profil metilacije DNK spermijev. Materiali in metode Analizirali smo seme pacinentov vključenih v naš program zdravljenja neplodnosti. Polovica semena vsakega vključenega pacienta je bila pripravljena na ICSI po metodi DGC, druga polovica pa z DGC, ki mu je sledil MACS. Preostanek vzorca smo obdelali za analizo metilacije DNA z RRBS metodo (sekveniranje). Poleg profila metilacije DNK smo ocenili morfologijo in fragmentacijo DNK spermijev. Rezultati Analiza RRBS je pokazala, da je bila povprečna metilacija na celotnem genomu med obema skupinama podobna (skupina DGC proti MACS) in je znašala med 0,53 do 0,56. Poleg tega je analiza RRBS identificirala 99 različno metiliranih regij (DMR) in 800 različno metiliranih pozicij (DMP). V skupini DGC je bilo 43 DMR in 392 DMP hipermetiliranih, 56 DMR in 408 DMP pa hipometiliranih v primerjavi z MACS skupino. Ko je bilo DMR-jem in DMP-jem določeno, kje v genomu se nahajajo, so bili odkriti 3 geni, povezani z genetskim vtisnjenjem: IGF2, PRDM16 in CLF4 / BRUNOL4. Odstotek morfološko normalnih spermijev (MACS v primerjavi z DGC; 14,0 ± 10,8 v primerjavi z 13,2 ± 10,0; P = 0,335) in spermijev s fragmentirano DNK pri katerih je bila narejena analiza RRBS (22,9 ± 21,1% v primerjavi z 34,4 ± 21,2; P = 0,529 ) je bil med skupinami podoben. Razprava in zaključek Čeprav je bila povprečna metilacija DNK spermijev na celotnem genomu podobna v obeh preiskovanih skupinah, smo na nivojih DMR in DMP opazili določene spremembe v metilaciji. Za potrditev naših ugotovitev je potrebno analizirati večje število vzorcev in preizkusiti dodatne metode priprave sperme.