Infekcija centralnega živčnega sistema z virusom HIV-1 povzroča nevrokognitivne motnje, povezane z virusom HIV, tudi pri aviremičnih bolnikih. Čeprav je bilo nepravilno delovanje astrocitov povezano s temi motnjami, njihove posledice zasenčijo vplivi mikroglij in makrofagov. Astrociti so okuženi z virusom HIV-1 in vivo in izražajo ustrezno količino virusnega proteina Nef. Pokazalo se je, da Nef sprosti lastno sproščanje v eksosome iz različnih vrst celic, kar ima škodljive učinke na okolijske celice. Z uporabo imunoblotinga in elektronske mikroskopije smo pokazali, da človeški astrociti, ki izražajo Nef.GFP, prav tako podobno sproščajo Nef z eksosomi. Pomembno je, da ekspresija Nef.GFP poveča izločanje eksosomov iz človeških astrocitov do 5,5-krat, ugovoljeno s celokupno vsebnostjo beljakovin in analizo sledenja nanodelcev. Analiza beljakovinske sestave eksosomov in virusov, ločenih na gradientu iodiksanola, je nadalje pokazala, da izvorni ali psevdotipski humani astrociti, okuženi z virusom HIV-1, sproščajo eksosome, ki vsebujejo Nef. Naši rezultati so osnova za prihodnje študije preučevanja škodljive vloge Nef-eksosomov sproščenih iz s HIV-om okuženih astrocitov na osrednji živčni sistem.
COBISS.SI-ID: 33351641
Za ovrednotenje vloge aktivnega rezervoarja virusa HIV pri kroničnem vnetju in posledično pri obolenjih, nepovezanih z AIDS-om, najprej potrebujemo enostaven in natančen test, ki bo izmeril izražanje virusnih proteinov pri aviremičnih bolnikih. V ta namen smo optimizirali encimsko-imunski test za detekcijo Nef-a (Nef-ELISO) in ga uporabili za določitev koncentracije Nef-a, kot označevalca aktivnih rezervoarjev v kohorti bolnikov, okuženih s HIV. V okviru študije smo analizirali 134 vzorcev plazme s HIV-om okuženih posameznikov in neokuženih kontrol iz prospektivne opazovalne študije SCOPE (San Francisco). Nef-ELISO smo optimizirali na neokuženih (odsotnost Nef-a) in okuženih, nezdravljenih (prisoten Nef) posameznikih ter ocenili uporabnost testa za detekcijo koncentracije Nef-a v plazmi na aviremičnih bolnikih, ki raven virusa v plazmi kontrolirajo brez (elitni kontrolerji) ali z zdravili (ART). S pomočjo Nef-ELISE smo pokazali, da koncentracija Nef-a v plazmi korelira s koncentracijo RNA HIV v plazmi pri nezdravljenih bolnikih, okuženih s HIV. Obratno pa smo pri polovici aviremičnih bolnikov (elitni kontrolerji, ART), kjer v plazmi ni bilo prisotne RNA HIV, detektirali Nef v plazmi. Koncentracija Nef-a v plazmi okuženih bolnikov ni bila dosledno povezana z nobeno od naslednjih kliničnih značilnostih: koncentracija CD4+ in CD8+ celic, razmerje med CD4+ in CD8+ celicami in najnižjo koncentracijo CD4+ celic pred zdravljenjem. Odsotnost RNA HIV nakazuje na odsotnost virusa HIV v plazmi, zato izvor Nef-a v plazmi aviremičnih bolnikov najverjetneje predstavlja aktivni rezervoar HIV-a. V nadaljnjih študijah se bomo osredotočili na izboljšanje občutljivosti Nef-ELISE, kar bomo poskusili doseči z uporabo kvalitetnejših protiteles proti Nef-u, in na natančnejšo karakterizacijo rezervoarjev HIV-a z alternativnimi metodami.
COBISS.SI-ID: 33608665
Določanje velikosti rezervoarja HIV-1 pri okuženih posameznikih je zelo pomembno za izboljšanje njihovega zdravljenja. Kot eden od možnih biooznačevalcev je bil predlagana v plazmi prisotna TAR-(angl. trans-activation response element) RNA, ki nastaja med neprocesivnim preprisovanjem z virusom HIV-1 aktivno okuženih in latentnih celic T. V tej študiji smo določali prisotnost TAR RNA v vzorcih plazme in pripadajočih vzorcih eksosomov 55 oseb iz kohortne študije SCOPE. Najprej smo optimizirali analizo vzorcev na osnovi PCR, s katero smo dosegli 100% specifičnost ter občutljivost pri ločevanju neokuženih posameznikov od HIV-pozitivnih ne-zdravljenih posameznikov. Kasneje je bila TAR RNA določena v plazmi 63% aviremičnih bolnikov, ki so bodisi okuženih s HIV-1 a zdravljeni z protiretrovirusno terapijo oziroma so elitni kontrolerji virusa HIV-1. Kljub temu, da prisotnost TAR RNA v vzorcih ne korelirala s spolom, starostjo, nivojem CD4 ali CD8, se kaže povezava z razmerjem celic CD4 / CD8 (P = 0,047). To je prva študija, ki preiskuje plazemsko TAR RNA v razmeroma veliki kohorti bolnikov, okuženih z virusom HIV-1. Poleg tega dokazujemo, da molekule TAR RNA v plazmi aviremičnih bolnikov niso omejene izključno na eksosome.
COBISS.SI-ID: 33286873
Zunajcelični vezikli so heterogena populacija membranskih veziklov s pomembno vlogo v medcelični komunikaciji, ki so iz celic v zunajcelični prostor sproščeni tako in vivo kot tudi in vitro. Izolirali so jih iz raznolikih bioloških vzorcev kot so kri, bronhoalveolarni izpirek, sinovialna tekočina, urin, plodovnica, sperma, mleko, slina; ter iz kultur večine tipov sesalčjih celic. Glede na velikost in mesto nastanka v celici, zunajcelične vezikle ločimo na eksosome (30–100 nm), mikrovezikle (100–1.000 nm) in apoptotska telesca (1.000–5.000 nm). Njihova proteinska, nukleinska (miRNA) in lipidna sestava odseva sestavo celice izvora in je odvisna od trenutnega stanja celice. Posledično so zunajcelični vezikli postali pomemben vir novih biooznačevalcev za raznolika telesna stanja s pomembno diagnostično in prognostično vrednostjo, še posebno za bolezni centralnega živčevja. Raziskave potekajo tudi v smeri ciljanja zunajceličnih veziklov v diagnostične in terapevtske namene, pri čemer pa se znanstveniki srečujejo s številnimi preprekami. Ravno zaradi velikega kliničnega potenciala, se je zanimanje za karakterizacijo, nastanek in vlogo zunajceličnih veziklov v zadnjih letih močno povečalo, pri čemer je prišlo tudi do pomembnega napredka pri razvoju metod za njihovo izolacijo in analizo. V tem preglednem članku bomo opisali vrste zunajceličnih veziklov in metode za njihovo izolacijo in analizo, ter njihovo biološko vlogo in klinični potencial.
COBISS.SI-ID: 32578521
S hipoksijo inducirani faktorji (HIF) spadajo v družino transkripcijskih dejavnikov odzivnih na nizko vsebnost O2, ki je pogosto značilna za čvrste tumorje. Alfa podenota heterodimera HIF je na O2 –občutljiva in ko stabilna med hipoksijo, deluje kot osrednji regulator številnih genov vključenih v signalne poti hipoksije. Spremembe v nukleotidnem zaporedju HIF1A (HIF1 alfa-podenota) ali njegovo izražanje so do sedaj že bile povezane z razvojem številnih bolezni. Zaradi vse večjega zanimanja v preučevanje gena HIF1A je bil pregled obstoječih analiz povezav ključnega pomena. V teh študiji smo pregledali že objavljene podatke o polimofizmih posameznega nukleotida (angl. single nucleotide polymorphism; SNP) HIF1A pri različnih boleznih; v celoti je bilo preučevanih 34 SNP-jev v povezavi s 49 fenotipi, rezultati pa so prikazani z uporabo programske opreme Cytoscape. Med vsemi zbranimi polimorfizmi je bilo 16 SNP-jev značilno povezanih s 40 različnimi fenotipi, vključno s 6 SNP povezanih s 14 različnimi tipi raka. V analizah povezav sta bila najpogosteje preučevana drugačno-pomenska SNP-ja (angl. missense; rs11549465 in rs11549467) locirana znotraj na kisik občutljive domene. Ta študija predstavlja uporabno orodje za raziskovalce s tega področja in lahko prispeva k bolj natančni diagnozi bolezni in določevanju terapevtskih ciljev.
COBISS.SI-ID: 3859080