Toksini in biomembrane

Marsikateri farmakološko-aktivni proteini so že bili s pridom uporabljeni v biomedicini bodisi kot raziskovalno orodje, diagnostično ali terapevtsko sredstvo, žal pa tudi v bioterorizmu. Natančno poznavanje mehanizmov delovanja takšnih beljakovin je predpogoj za njihovo koristno uporabo pa tudi za obrambo pred njimi. Sekretorne fosfolipaze A2 (sPLA2) so encimi, ki izražajo številne fiziološke in patološke učinke kot so vnetni procesi, razgradnja lipidov, celična signalizacija, obramba oganizma, imajo pa tudi pomembno vlogo pri rakastih obolenjih. Nas še posebej zanima amoditoksin (Atx), presinaptično nevrotoksična modrasova sPLA2. Živčni končič izpostavljen Atx ima močno prizadete mitohondrije, na plazmalemi so vidne vbokline, ki se ne morejo endocitirati, v citosolu pa se močno zmanjša število sinaptičnih veziklov. Izoliramo in karakteriziramo bomo vezavne proteine za Atx v živčnih, pa tudi drugih tkivih. Ugotavljamo vpletenost teh proteinov v proces nevrotoksičnosti in v druge (pato)fiziološke procese, s tem pa iskali ali pojasnjevali tudi vloge sorodnih organizmu lastnih (endogenih) sPLA2, ki so v glavnem še zelo slabo poznane. Za študij evolucije naddružine fosfolipaz A2 pri evkariontih uporabljamo številne nove genomske podatke, ki nam bodo precej olajšali razumevanje te velike skupine proteinov. Študij adaptivne evolucije bomo nadaljevali pri različnih multigenskih družinah, ki kodirajo proteine, vključene v obrambo različnih organizmov kot so metaloproteinaze, inhibitorji serinskih proteinaz, perforini in tionini. Raziskave evolucije transpozicijskih elementov (TE) pri evkariontih bomo nadaljevali z iskanjem TE po različnih podatkovnih bazah z genomskimi zaporedji številnih organizmov ("in silico" pristop), ki so večinoma nepreiskane. V povezavi z evolucijskimi analizami bomo dobili globalen vpogled v izvor, evolucijo in raznolikost TE pri evkariontih, ki je še vedno precej fragmentarna. Neencimsko delujejo na biomembrane snovi-tvorci por, ki so najbolj razširjena skupina med toksini nasploh. Ožigalkarskemu ekvinatoksinu, človeškemu perforinu, gobjemu ostreolizinu, nemertinskemu parborlizinu in alkilpiridinijevim polimerom iz spužev je skupno, da tvorijo trajne ali začasne pore v lipidnem delu biomembran, s čimer povzročijo v celici vrsto nekontroliranih procesov in končno nekrotično ali apoptotično celično smrt. Alkilpiridinijevi polimeri iz spužve Reniera sarai so se izkazali za inhibitorje acetilholinesteraze ter učinkovite, nedetergentske tvorce por v bioloških membranah. Glede na preliminarne rezultate bomo raziskali možnost njihove uporabe za preprečevanja naseljevanja podvodnih površin z organizmi (t.i. antifouling).

Raziskave, ki jih izvajamo v okviru programske skupine, lahko v grobem razdelimo na toksinološke raziskave, raziskave sesalskih sPLA2 in tvorcev por, fenomiko kvasovk in analizo genomov, tj. sklopov, ki se med seboj prepletajo in dopolnjujejo. Na področju toksinologije smo usmerjeni v analizo molekularnih mehanizmov delovanja različnih komponent živalskih strupov z namenom razvoja novih molekularnih orodij za raziskave v fiziologiji in medicini, za razvoj inovativnih bioloških zdravil (antitrombotiki, citostatiki, analgetiki, imunotoksini) in obrambo pred delovanjem strupov (detekcija in terapija, tako v povezavi z medicino kot bioterorizmom). Toksini, ki jih raziskujemo, delujejo na različne načine in na različne tipe celic. Poudarek je na študiju mehanizma delovanja nevrotoksinov, zlasti presinaptično nevrotoksičnih sPLA2, citolizinov, zlasti tvorcev por in miotoksičnih sPLA2, ter komponent strupov, ki vplivajo na hemostazo. Dognanja na molekularni ravni bodo po pričakovanju imela velik pomen pri raziskavah strukture in dinamike bioloških membran (npr. regulirane ekso- in endocitoze), usmerjanja proteinov v celicah ter pri iskanju novih poti za terapijo tromboembolitičnih bolezni npr. akutnega srčnega infarkta, pljučne embolije, kapi in periferne arterijske okluzije. Naše raziskave so usmerjene v pojasnjevanje in zdravljenje nevroloških motenj, ki so posledica nepravilnosti cikla sinaptičnih veziklov, in uravnavanje hemostaze. sPLA2 so prožilci signalnih kaskad (lipidno signaliziranje) in ključen dejavnik v metabolizmu lipidov pri sesalcih. Poznavanje uravnavanja teh procesov je ključnega pomena za razumevanje bolezni in motenj metabolizma, kot so nekatere nevrološke bolezni, npr. Zelwegerjev sindrom, Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen, kardiovaskularna obolenja, ateroskleroza, diabetes tipa 2 in debelost. Membranski rafti so udeleženi v številnih ključnih bioloških procesih v zdravem organizmu, saj delujejo kot platforme za ustaljene signalizacijske poti, obenem pa njihova disfunkcionalnost/okvara privede do različnih bolezenskih stanj. Za membranske rafte je tako bilo ugotovljeno, da igrajo pomembno vlogo v nevroloških, (Alzheimerjeva, Parkinsonova in prionske bolezni) in kardiovaskularnih boleznih, v karcinogenezi in pri imunskih boleznih kot je sistemski lupus eritematozus ter pri okužbi z virusom HIV, kar naredi membranske rafte izjemno zanimive tarče v luči farmakoloških pristopov za zdravljenje in preprečevanje teh bolezni. V okviru PS smo razvili stabilno, netoksično rekombinantno fluorescenčno različico proteina ostreolizina A za katerega smo pokazali, da se veže na s holesterolom in sfingomielinom bogata področja v membranah celic. Z omenjenim označevalcem smo tudi dokazali obstoj teh domen v celicah in spremljali njihovo dinamiko potovanja po celici. Razvita molekula bi lahko v prihodnosti služila kot ključno (in do sedaj edino) orodje v bazičnih in aplikativnih biomedicinskih raziskavah biologije membranskih raftov in z njimi povezanih patoloških stanj. Raziskave delovanja proteinov egerolizinske družine, ki so potencialni virulenčni dejavniki pri okužbah z oportunistično patogenimi plesnimi, lahko prispevajo k boljšemu razumevanju patogeneze in vloge toksinov v razvoju obolenja, kot tudi k terapiji in predvsem pri preprečevanju bolezni pri živalih in človeku. Raziskave genov beljakovin modrasovega strupa so tudi pomembne za pojasnitev mehanizma pospešene ali adaptivne evolucije mnogih proteinskih družin v živalskih strupih. Raziskave bodo med drugim pokazale, kateri deli toksinskih molekul so dostopni za razvoj novih funkcij, ne da bi se njihova 3D-struktura porušila. Na osnovi teh podatkov bo možno načrtovati beljakovine z novimi lastnostmi, kar je ključnega pomena za razvoj novih učinkovin. Raziskovalna problematika skupine je zelo aktualna, naši rezultati pa mednarodno odmevni.

Raziskave programske skupine so tako bazičnega kot aplikativnega značaja. Poleg tega, da prispevajo v svetovno zakladnico znanja, imajo tudi praktično vrednost. Tako npr. razvijamo postopke za pridobivanje bolj učinkovitih in varnih protistrupov, alternativnih protitumorskih sredstev, antikoagulantnih učinkovin, antitrombotikov in učinkovin za transfekcijo celic s tujerodno DNA (alkilpiridinijeve soli). Razvijamo tudi netoksične antivegetativne premaze (antifouling) za zaščito podvodnih površin. Zelo pomemben vidik naših raziskav je usvajanje najnovejših tehnologij, zlasti na področjih funkcijske genomike. V okviru naših raziskav tako uvajamo v svojih laboratorijih tehnologijo DNA-mikromrež, tehnologijo sistematičnega določanja genetskih interakcij (SGA), najnovejše bioinformacijske metode in proteomiko. Ob tem tudi aktivno sodelujemo pri razvoju najnovejših raziskovalnih metod. V sodelavi z domačim visokotehnološkim podjetjem smo razvili manipulator za avtomatsko replikacijo urejenih kolonij mikroorganizmov (kvasovk), ki nam bo omogočil konkurenčnost v evropskem merilu pri analizi proteinskih toksinov in drugih biološko aktivnih snovi na genomski ravni, sodelujemo pri razvoju novih bioinformatskih orodij za analizo rezultatov genomskih poskusov in razvijamo nove metode za študij interakcij med proteini in lipidnimi membranami na osnovi SPR. Kot taka, naša skupina predstavlja jedro, iz katerega izhajajo kadri, usposobljeni za delo z najnovejšimi tehnikami biokemije, farmakologije, molekularne biologije in genetike. Dejavnost skupine je pomembna tudi za postavitev sodobnih, na biotehnologiji temelječih podjetij in laboratorijev kot sestavnega dela slovenskega gospodarstva. Zato naše največje farmacevtsko podjetje Lek-Novartis z našo skupino intenzivno sodeluje. Naša dejavnost je prav tako pomembna za zdravstvo in obrambo - interes za delovanje na slednjem področju se kaže v podpori NATA našim raziskavam, povezanih z bojem proti bioterorizmu, in pa zanimanju MORS za naš razvoj biosenzorjev za občutljivo, hitro in mobilno detekcijo kemijskih in bioloških toksinov na terenu. Zelo pomembna je sodelava pri vzgoji mladih raziskovalcev in posredovanje v raziskavah pridobljenih znanj slovenskim študentom. Večina članov programske skupine je intenzivno vpeta v pedagoško delo na dodiplomskem in podiplomskem nivoju: na UL, UM, UNG in na Mednarodni podiplomski šoli Jožefa Stefana. Nekateri člani programske skupine so nosilci prenove visokošolskih programov v skladu z bolonjsko reformo. Vrsta mladih raziskovalcev, ki se je usposabljala ob naših raziskavah (izdelava diplomskih, magistrskih in doktorskih del) je odšla v raziskovalne laboratorije različnih raziskovalnih inštitutov in univerz, medicinske klinične laboratorije in v farmacevtsko industrijo. S številnimi objavami v visoko citiranih mednarodnih znanstvenih revijah, s predavanji na mednarodnih kongresih in akademskih institucijah ter v industriji in z organizacijo mednarodnih znanstvenih srečanj naša raziskovalna skupina nedvomno prispeva k uveljavitvi slovenske znanosti, tega pomembnega dela nacionalne kulture in samobitnosti, v svetu. Skupina je vzpostavila in vzpostavlja mednarodne sodelave z vrsto uglednih raziskovalcev in institucij širom sveta. Člani naše skupine so opravljali ali opravljajo nekatere vodilne funkcije v organih evropskih in svetovnih strokovnih združenj (trenutno dr. Igor Križaj opravlja nalogo sekretarja Evropske sekcije IST in člana sveta Mednarodne IST), kar vse dodatno krepi našo nacionalno identiteto in prepoznavnost v svetu. Del naših raziskav prispeva tudi k ohranjanju bogastva naravne dediščine naše avtohtone favne in k razumevanju njene relativno velike biološke raznovrstnosti, ki je ena od pomembnih značilnosti majhne Slovenije.