Specifičnost interakcij nekaterih citolitičnih beljakovin z membranskimi lipidnimi domenami

Vezava in tvorba por s citolitičnima proteinoma ekvinatoksinom II (EqtII), ki je predstavnik aktinoporinov, in ostreolizinom (Oly) iz egerolizinske proteinske družine, sta odvisni od posebne lipidne sestave tarčne membrane. EqtII se veže in oligomerizira v membranah, ki vsebujejo sfingomielin, medtem ko ima Oly preferenco za zmes sfingomielina in holesterola. Ker je znano, da ta lipida tvorita posebne membranske domene, napr. lipidne rafte, bomo preučili vezavo in tvorbo por EqtII oz. Oly na lipidnih monoslojih in malih, velikih ter orjaških unilamelarnih veziklih (SUV, LUV, GUV) v odvisnosti od pojavljanja lipidnih domen v teh modelnih membranah. Za primerjavo bomo uporabili tudi heteronemertinski citolizin parborlizin in čebelji melitin, za katera je znano, da imata manjšo specifičnost za lipide. Ugotavljali bomo tudi, ali se citotoksin iz patogene bakterije Clostridium difficile, ki tudi tvori pore, specifično veže v katero od domen. Lipidne domene v SUV in LUV bomo zasledili in ovrednotili z analizo spektrov elektronske paramagnetne resonance (EPR) spinskih označevalcev, vgrajenih v membrane veziklov, iz katerih bomo določili ureditveni parameter in deleže posameznih membranskih domen. Uporabili bomo tudi fluorescentne lipidne označevalce za specifične lipidne domene v lipidnih monoslojih in GUV iz binarnih oz. trojnih lipidnih zmesi sfingomielina, holesterola, palmitoil-oleilfosfatidil-holina (POPC), ali dioleil-fosfatidilholina (DOPC). Dodatno bomo pripravili rekombinantne oblike EqtII in Oly za vezavo fluorescenčnih označevalcev na osnovi tiolne kemije. Po vezavi označenih citolizinov (aktivnih ali z zmanjšano aktivnostjo) na monosloje in GUV bomo zasledovali njihovo lateralno razporeditev s pomočjo epifluorescenčne mikroskopije ter to vzporejali z vzorci fluorescenčno označenih lipidnih domen. Dodatno bomo v primeru GUV analizirali njihovo obliko v povezavi s pojavljanjem lipidnih domen ter lateralno distribucijo označenih proteinov v ravnini membrane. Glede na to, da se tako sfingomielin kot holesterol značilno koncentrirata v tekoči urejeni lipidni fazi, nameravamo tudi razviti postopek za pripravo fluorescenčno označenih EqtII oz. Oly, ki bi specifično zaznavala tekočo urejeno ali druge lipidne faze v umetnih lipidnih in bioloških membranah.