Analiza interakcij med inhibitorji (stefini) in papainu podobnimi cisteinskimi proteazami

Sedanje razumevanje mehanizma interakcije med inhibitorji cistatinskega tipa in njihovimi tarčami, lisozomskimi cisteinskimi proteazami, sloni na strukturah kurjega cistatina in kompleksa stefina B vezanega na karboksimetiliran papain in vrsti kinetičnih meritev. Sistematično bomo poskusili zapolniti vrzeli v literaturi in raziskati vlogo N-koncev stefinov. N-konci so edini deli v strukturah stefinov, ki tvorijo specifične interakcije s proteazami. Poskusilii bomo odgovoriti tudi na vprašanje pomena zvitja proteina pri interakcijah s proteini. Gre za to, ali je vloga zvitja inhibitorja le v tem, da približa svoji tarči kompatibilno površino, ali k temu prispevajo tudi interakcije dolgega dosega, ki delujejo na vezavo med samim zbliževanjem oyiroma ločitvijo dveh molekul. Odgovore na ta vprašanja nameravamo pridobiti s kombinirano uporabo metod proteinskega inženiringa, encimske kinetike, rentgenske kristalografije in mikroskopije na atomski sili. Študij encimske kinetike (določevanje inhibicijskih konstant v odvisnosti of ionske jakosti medija) nam bo dal osnovne podatke o vlogi elektrostatike pri teh interakcijah. Z mikroskopijo na atomski sili pa bomo spremljali sile, ki delujejo med približevanjem in oddaljevanjem dveh molekul kot tudi sile, ki držijo dve molekuli v tvorjenem kompleksu skupaj. Poznavanje 3-dimenzionalnih struktur dobljenih z metodo rentgenske kristalografije pa bo ključnega pomena pri načrtovanju mutant stefinov uporabnih za izvedbo kinetčnih meritev in meritev sil mikroskopije na atomski sili ter njihovo interpretacijo.