Genska imunska terapija čvrstih tumorjev na osnovi mRNA z zapisom za interlevkin-12: So-rIL

Gensko zdravljenje je terapevtska strategija, ki uporablja gene kot terapevtske dejavnike. Med gensko terapijo se terapevtski gen vstavi v ciljne celice z različnimi nameni, vključno s spodbujanjem imunskega odziva. Največkrat uporabljeni vektorji za dostavo nukleinskih kislin so virusni, veliko pozornosti na področju genske terapije pa je usmerjene v razvoj plazmidne DNA, ki jo v celice dostavljamo na različne načine, med drugim tudi z elektroporacijo – genski elektroprenos (GET). Za plazmidne vektorje velja, da so varnejši od virusnih in jih je mogoče dostaviti več kot enkrat. Poleg tega lahko vsebujejo dolg genetski zapis in jih je relativno enostavno in poceni izdelati. Kljub temu obstajajo tudi določeni pomisleki glede uporabe plazmidne DNA, kot so integracija v celično DNA, nizka učinkovitost prenosa v celice, povzročanje avtoimunskih reakcij in horizontalni prenos gena za odpornost na antibiotike v črevesni mikrobiom. Genska terapija na osnovi mRNA je trenutna alternativa k terapijam na osnovi plazmidne DNA. mRNA transkripti imajo razmeroma visoko učinkovitost transfekcije, saj jim za delovanje ni treba vstopiti v jedro. Prednost terapije na osnovi mRNA pa je tudi v relativno kratki razpolovna dobi, ki omogoča prehodno in bolj nadzorovano izražanje kodiranega terapevtskega proteina, prav tako jo lahko proizvajamo v okolju brez celic, s transkripcijo in vitro (IVT). To omogoča preprosto prečiščevanje v nadaljnjem postopku ter hitro in stroškovno učinkovito proizvodnjo, kar dolgoročno vodi v zmanjšanje stroškov za zdravljenje raka. Namen predlaganega projekta bo določiti protitumorsko učinkovitost GET mRNA z zapisom za interlevkin – 12 (IL-12; mRIL12), ter določiti njihov vpliv na aktivacijo PRRs. IL-12 smo izbrali zato, ker trenutno izvajamo klinično študijo faze I genske terapije z GET plazmidne DNA z zapisom za IL-12 in si želimo razširiti nabor uporabe možnih zdravil oz. pripraviti še bolj dostopno terapijo. V raziskavi bomo GET in lipofekcijo mRIL12 ter GET pmIL12, izvedli na dveh mišjih celičnih linijah, melanomski celični liniji B16F10 in celični liniji kolorektalnega karcinoma CT26. Na in vitro nivoju bomo v različnih časovnih točkah po GET in lipofekciji mRIL12 z različnimi kemijskimi spremembami, ki vplivajo na imunogenost mRNA, spremljali delež transfekcije mRNA, preživetje posameznih celičnih linij po terapijah, spremljali bomo proteinski nivo IL-12, nivo biološke aktivnosti IL-12 po terapiji ter nivo izražanja genov različnih vzorčno prepoznavnih receptorjev, ki se aktivirajo zaradi prisotnosti terapevtske mRNA v celicah po terapiji. Enake parametre bomo nato spremljali po GET s plazmidno DNA ter jih primerjali med sabo. V nadaljevanju bomo vse zgoraj omenjene terapije ovrednotili v in vivo pogojih. Z merjenjem zaostanka v rasti tumorjev, preživetja živali, določevanjem vpliva na rast sekundarnih tumorjev (abskopalni učinek), bomo določili protitumorsko učinkovitost. Toksičnost in imunogenost bomo določevali s spremljanjem kliničnih znakov, krvnih analiz in prisotnostijo mRNA v različnih tkivih. Z imunofluorescenčnim barvanjem zmrzlih tumorskih rezin pa bomo določili pristotnostjo različnim imunskih celic v tumorskem mikrookolju. Pričakujemo, da bodo protitumorski učinki GET izbrane mRNA večja od protitumorskih učikov lipofekcije z izbrano mRNA in primerljiva s protitumorskim učinkom GET plazmidne DNA. Rezultati predlaganega projekta bodo tako odprli novo možnost za uporabo imunske genske terapije, ki bo temeljila na uporabi mRNA.