Raziskave teranostičnega potenciala egerolizinskih proteinov v boju proti raku sečnega mehurja

Razvoj novih metod, ki omogočajo prostorsko zaznavanje specifičnih membranskih lipidov s ciljem proučevanja njihove vpletenosti v celične funkcije, ali za ciljanje lipidov v terapevtske namene, predstavlja hitro razvijajoči se pristop v biomedicini. Glavna prednost ciljanja lipidov v primerjavi s ciljanjem proteinov je, da lipidi niso nagnjeni k razvoju odpornosti, ki se lahko pojavlja pri različnih proteinskih receptorjih.  Sfingomielin (SM) je poglavitni sfingolipid celičnih membran vretenčarjev, katerega vsebnost in povezovanje z ostalimi membranskimi lipidi vpliva na različne celične funkcije. Sfingomielin se še posebej dobro povezuje s holesterolom, s katerim tvori membranske rafte. Gre za membranske domene, ki preko segregacije za rafte specifičnih proteinov delujejo kot funkcionalne platforme v številnih procesih v zdravi celici ter pri bolezni (npr. imunsko signaliziranje, interakcija s patogeni, rak). Preurejanje membranskih lipidov poteka tudi med procesom programirane celične smrti (apoptoze). Pri apoptozi se na površini plazemske membrane izpostavijo lipidi, ki normalno niso vezani na zunanjo plast te membrane (npr. fosfatidilserin ali kardiolipin). Ti lipidi predstavljajo signale, ki fagocitom omogočajo prepoznavanje apoptotične celice in njeno odstranitev. Izbrani egerolizini, lipidno-vezavni proteini iz užitnih gob rodu Pleurotus, predstavljajo odlične kandidate za detekcijo in označevanje zgoraj omenjenih lipidov. Zaradi sposobnosti specifične interakcije s kardiolipinom, s SM v kompleksu s holesterolom, kakor tudi s prostim SM, so egerolizini pomembo orodje za detekcijo teh lipidov v membranah živih sesalskih celic. Poleg tega egerolizini v prisotnosti specifičnega proteinskega partnerja, ki vsebuje MACPF domeno, tvorijo pore v tarčnih membranah. Te citolitične komplekse lahko uporabljamo za uničevanje, ki vsebujejo egerolizinski membranski lipidni receptor. Egerolizin ostreolizin A6 (OlyA6) iz glive Pleurotus ostreatus specifično zaznava in se veže na SM v kompleksu s holesterolom v membranskih raftih, ter predstavlja idealno netoksično orodje za proučevanje strukture in dinamike raftov v živih celicah. Poleg tega nativni izolat te glive, ki vsebuje zmes OlyA6 in njegovega MACPF-partnerskega proteina specifično uničuje urotelijske rakave celice, ki v primerjavi z normalnimi celicami imajo povečano vsebnost membranskih raftov. Poleg tega vsebuje apikalna membrana zdravih urotelijskih celic posebne proteine, uroplakine, ki urotelijske plake urejajo v kristalne strukture, ki onemogočajo vezavo kompleksa OlyA6/PlyB na lipidne rafte. Mutanta OlyA6-E69A lahko interagira tako s prostim, kot tudi s holesterolom vezanim SM. Zadnji od preučevanih proteinov je erilizin A (EryA) iz glive P. eryngii, ki se ne veže na membrane, ki vsebujejo SM/holesterol in posledično ni označevalec membranskih raftov, se pa veže na kardiolipin.  V predlaganem projektu želimo kritično ovrednotiti potencial rekombinantnih lipidno-vezavnih egerolizinskih proteinov OlyA6, OlyA6-E69A in EryA, samih ali v kombinaciji z MACPF-proteinskimi partnerji, kot teranostičnih sredstev v biomedicini. Fluorescenčno označen EryA, ki zaznava kardiolipin, bo ovrednoten kot molekularni označevalec apoptotičnih sesalskih celic, medtem ko bosta fluorescenčno označena proteina OlyA6 in njegov mutant E69A testirana kot komplementarna orodja za detekcijo in proučevanje prostega in s holesterolom vezanega SM v membranah živih sesalskih celic. S fluorescenčno označenimi egerolizini bomo ravno tako specifično označili urotelijske rakave celice, ali pa z egerolizin/MACPF kompleksi povzročili njihovo permeabilizacijo. Z vezavnimi testi na umetnih in bioloških membranah, fluorescenčnimi mikroskopskimi tehnikami in testi toksičnosti bomo izbrali najbolj učinkovit egerolizin/MACPF kompleks za nadaljnjo uporabo pri zdravljenju urotelijskega raka.