DELNO-INTEGRIRANA SILICIJEVA MIKRO qPCR NAPRAVA ZA HITRO ODKRIVANJE PATOGENOV NA SAMEM MESTU

Zaradi nalezljivih bolezni, kot je npr. nedavni primer koronavirusa v letu 2019, se vse bolj izpostavlja potreba po diagnostičnih testih na mestu oskrbe (POC). Testi, ki so hitri, natančni, poceni in enostavni za uporabo na terenu bi lahko ustavili epidemijo, preden bi se ta razvila v pandemijo. Za odkrivanje patogenov se pogosto uporablja verižna reakcija s polimerazo (PCR), ki je priznana kot zlati standardni test v diagnostiki. PCR za POC je še vedno raziskovalno področje v povojih, zato je podpora predlaganim raziskovalnim aktivnostim bistvenega pomena za razvoj področja. Glavni cilj predlaganega projekta je razviti polintegrirano napravo mikro-qPCR na osnovi silicija za hitro odkrivanje patogenov na kraju samem. Raziskave se bodo osredotočile na razvoj miniaturne naprave z nizkimi toplotnimi izgubami in inovativno časovno odzivno strukturo termičnega ciklerja (termociklerja) v sestavi ""dvojnega mostu"". Druge ključne komponente sistema PCR, kot so mikrofluidni čip za obogatitev analiznega vzorca, čip reakcijske komore in namenska krmilna elektronika za nadzor temperature termociklerja v povezavi s fluorescenčno detekcijo, bodo zgrajene okoli zasnovanega termociklerja tako, da bodo izpolnjevale zahteve analiznih sistemov POC PCR. Poleg tega bomo raziskali rešitve za izvedbo optimalnega sistema za optično zaznavanje fluorescence ter razvili krmilno elektroniko in programsko opremo za prikaz rezultata testa PCR na platformi osebnega računalnika ali pametnega telefona. Na področju zbiranja in priprave vzorca bomo raziskali dve strategiji za čiščenje in koncentriranje NA iz vzorcev na minimalni elucijski volumen, ki se uporabi za analizo v napravi mikroPCR, tj. magnetne kroglice, prevlečene s silicijevim dioksidom in s silicijem/PDMS modificirane mikrostebričke v mikrofluidnem čipu. Raziskali bomo tudi najprimernejšo strategijo za nadzor pretoka v mikrokanalu zasnovanega mikrofluidnega čipa, pri čemer bomo dali prednost izdelavi čipa s pasivnimi mikrofluidnimi komponentami. Naše izhodiščno merilo za razvoj reakcijske komore je, da mora biti čim manjša, da predstavlja minimalno toplotno obremenitev za termocikler ter da je za enkratno uporabo in poceni. Zato predlagamo razvoj miniaturnega čipa z reakcijsko komoro s prostornino nekaj mm3, zgrajenega na tanki stekleni podlagi ter z virtualno reakcijsko komoro, ki temelji na hidrofobnih/oleofobnih površinah. S tem v zvezi nameravamo razviti komoro na enem samem čipu in tudi komore na celotnem steklenem substratu. Slednje bo omogočilo izdelavo več čipov hkrati, kar je zelo pomembno, da se omogoči namembnost za enkratno uporabo. Kot alternativno rešitev predlagamo reakcijsko komoro z rezervoarjem iz elastomera PDMS. Poleg tega bomo v sistem vključili zaznavanje fluorescence, da bi potrdili učinkovitost razvoja komponent in sistema mikro qPCR. Učinkovitost obogatitve vzorca in pomnoževanja njegovih nukleinskih kislin (NAA) v razvijajočem se sistemu qPCR bomo ocenili z opazovanjem fluorescence pod fluorescenčnim mikroskopom z nameščeno kamero in v prilagojenem komercialnem sistemu za zaznavanje fluorescence, ki temelji na sistemu enega optičnega vlakna ali na sistemu, katerega optični del se bo prilegal termociklerju. Raziskovalne aktivnosti bodo vodile k razvoju avtonomnega prenosnega sistema qPCR, ki bo temeljil na inovativnem termociklerju z sledečimi zmogljivostmi: prostornina kapljičnega vzorca <1 µl, občutljivost na eno kopijo, dinamično območje 10 dekad, temperaturno območje od 5 °C do 100 °C z natančnostjo ± 0,2 °C, hitrost segrevanja in hlajenja med 10 °C/s in 20 °C/s, kar bo omogočilo pomnoževanje vzorca s PCR v manj kot 20 minutah.