Vpliv imunoterapije z anti-PD-L1 atezolizumabom in nanotelesom Nb202 na organoide glioblastoma pripravljene iz tkiva bolnikov

Glioblastom je najpogostejši maligni tumor možganov in eden najsmrtonosnejših rakov. Kljub standardni terapiji, ki vključuje maksimalno varno kirurško odstranitev tumorja, radioterapijo in kemoterapijo, večina bolnikov bolezni podleže v 2 letih. Zaradi nizke uspešnosti terapije so zato nujno potrebna nova in učinkovitejša zdravila ter strategije zdravljenja. Ena od možnosti zdravljenja, ki se je pri nekaterih vrstah raka izkazalo za izjemno učinkovito, je imunoterapija z uporabo inhibitorjev imunskih kontrolnih točk, zlasti z inhibitorji osi PD-1/PD-L1. Čeprav se je do sedaj izkazalo, da je glioblastom precej odporen na anti-PD-L1 in anti-PD1 inhibitorje, in vitro rezultati kažejo, da se vendarle na nanje odziva na podoben način kot ostali tumorji. Rezultati kliničnih testiranj tudi kažejo, da se določene skupine bolnikov na terapijo vseeno odzivajo. Iz rezultatov lahko sklepamo, da obstaja precej prostora za izboljšanje imunoterapije pri glioblastomu. Ena od takšnih izboljšav bi lahko bila uporaba nanoteles. Nanotelesa so deli težko-verižnih protiteles, ki prepoznajo antigen, in jih proizvaja le nekaj živali, na primer lame in morski psi. Imajo edinstvene in koristne lastnosti, na primer boljšo prodiranje v tumor v primerjavi s klasičnimi protitelesi, visoko stabilnost, visoko afiniteto in neimunogenost. V mojem projektu nameravam ovrednotiti citotoksični učinek nanotelesa anti-PD-L1 (Nb202), ki je bil pridobljen v našem laboratoriju. Predhodno smo z uporabo površinske pazmonske resonance pokazali, da je Nb202 specifičen za PD-L1 in ima visoko afiniteto (Kd=0,644 µM; predhodni in neobjavljeni rezultati). Naši predhodni rezultati tudi kažejo, da je izražanje PD-L1 več kot 50-krat višje v tkivu glioblastoma v primerjavi z referenčnim tkivom, zaradi česar je glioblastom primeren za ciljanje z inhibitorji PD-L1. Za namen vrednotenja učinkovitosti bomo najprej ustvarili organoide glioblastoma pripravljene iz tkiva bolnikov, ki bodo ohranili komponente imunskega sistema, da bi omogočili učinkovito testiranje imunoterapije. Za nasajanje organoidov bom uporabila sistem »air-liquid interface«, za katerega se je izkazalo, da je še posebno učinkovit sistem za gojenje organoidov, saj omogoča ohranitev originalnega mikrookolja, vključno z imunskim sistemom. Najprej bomo iz tkiva glioblastoma pridobili organoide. Po pridobitvi organoidov bomo na vzorcu originalnega tkiva in organoidih izvedli RNA sekvenciranje. Iz genske ekspresije bomo za vsak par tkivo-organoid ustvarili profil izražanja genov in ocenili, kako dobro organoidi odražajo originalni tumor. S prenosom western bomo tudi določili izražanje PD-1 in PD-L1 z in z uporabo histokemije določili prisotnost določenih imunskih celic. Nato bomo organoide tretirali z monoklonskim protitelesom atezolizumabom in nanotelesom Nb202, oba sta zaviralca PD-L1, pri čemer bomo uporabili enake koncentracije, kot so jih opazili v serumu bolnikov med zdravljenjem z atezolizumabom. Zmanjšanje rasti bo določeno s spremembo premera organoidov in s citotoksičnim testom WST-1. S histokemijo bomo analizirali tudi lokacijo atezolizumaba in Nb202, saj predvidevamo, da bo Nb202 zaradi svoje majhne velikosti bolje prodrl v organoid v primerjavi s klasičnim protitelesom, atezolizumabom. V zadnjem koraku pa bomo v tretiranih organoidih ovrednotili izražanje PD-L1 in PD-1 ter določili prisotnost imunskih celic. Namen predlagane raziskave je ovrednotiti možno uporabo Nb202 in atezolizumaba kot immunoterapevtika pri glioblastomu. Te raziskave nas bodo pripeljale korak bližje k razumevanju odziva tumorja glioblastoma na imunoterapijo, zlasti v kontekstu različnih načinov zdravljenja. Poleg tega bi lahko razvoj organoidov, pridobljenih iz tkiva bolnikov v prihodnosti omogočil natančnejše in zanesljivejše testiranje zdravil. Nenazadnje pa bi lahko z uporabo organoidov ter s tem tudi upoštevanjem biologije tumorja in njegovega mikrookolja kot celote natančneje napovedali odziv bolnika na določena zdravila.