Dinamični model molekulskega stroja DNA topoizomeraze tipa II in razvoj katalitičnih inhibitorjev

Rakava obolenja predstavljajo enega najpogostejših vzrokov smrti. Kompleksna narava nastanka tega bolezenskega stanja, združena z genetskimi predispozicijami in vplivom okolja, predstavlja izziv za uspešno terapijo, saj je učinkovitost le-te pogosto povezana s specifičnim odzivom posameznega rakavega tkiva. Raziskave novih molekul, ki bi učinkovito zdravile rakava obolenja na osnovi razumevanja molekularnih mehanizmov, povezanih z nastankom bolezni, so ena od prednostnih nalog na znanju temelječe družbe in že razvite protirakave zdravilne učinkovine stojijo v areni zgodovine kot veličasten triumf znanosti. V projektu se bomo osredotočili na skupino DNA topoizomeraz tipa II, kompleksnih molekularnih strojev, ki preko tvorbe kovalentnega kompleksa z DNA sproščajo dodatne zavoje DNA molekule in spreminjajo toplogijo DNA, kar je nujno za nemoten potek celične delitve. Za ta proces topoizomeraze uporabljajo energijo hidrolize molekule ATP. Pomemben predstavnik te skupine je človeška DNA topoizomeraza IIα (topo IIα), ki je uveljavljena protirakava tarča z mnogimi inhibitorji uvedenimi v klinično prakso. V projektu se bomo osredotočili na dva izziva, povezana s topo II molekulskim strojem. Prvi je povezan s tem, da navkljub intenzivnim raziskavam obstoječi strukturni in biokemični podatki o delovanju topo II omogočajo le omejen vpogled v katalitične in konformacijske aspekte tega večdomenskega encima, kot so na primer: konformacijske spremembe, povezane s prehodom T segmenta, opis gibanj N- in C- terminalnih domen na različnih korakih katalitičnega cikla encima ter tudi vpogled v katalitični mehanizem hidrolize ATP. Drugi izziv predstavljajo pomanjkljivosti topo II strupov, najpomembnejše skupine inhibitorjev tčloveške opo IIα, ki so del mnogih kemoterapij. Način delovanja teh zdravil, t.j. nastanek terciarnega kompleksa med DNA, topo IIα in topo II strupom, je namreč zaradi poškod DNA odgovoren za kardiotoksičnost in indukcijo sekundarnih tumorjev. Zato se trenutne raziskave osredotočajo na izboljšanje varnostnega profila te paradigme protirakave terapije. Raziskave obeh tematik bo v projektu izvajala interdisciplinarna raziskovalna skupina in bodo potekale v dveh smereh. Uporabili bomo rezultate strukturnih in biokemijskih študij in izvedli več molekulskih simulacij, tako klasične simulacije molekulske dinamike kot multiskalne QM/MM izračune za postavitev dinamičnega modela molekulskega stroja topoizomeraze tipa II. Računske raziskave bodo vključevale tako preučevanje katalitičnega mehanizma hidrolize ATP kot dolge molekulske simulacije izbranih korakov katalitičnega cikla topo II. Izvedli bomo tudi biokemijske eksperimente (npr. točkovne mutacije v ATP vezavnem mestu). Dobljeni modeli bodo povečali razumevanje mehanizmov, ki omogočajo, da topo II spreminja topologijo DNA, ter podali tudi smernice in ideje za nove eksperimente. Nadalje bomo v projektu ovrednotili terapevtsko še ne izkoriščeno paradigmo inhibicije človeške topo IIα s katalitičnimi inhibitorji, ki bi se vezali v ATP vezavno mesto na ATPazni domeni, in tako ustvarili katalitični cikel topo IIα. S tem pristopom bomo učinkovito zaobšli pomanjkljivosti, povezane z mehanizmom delovanja topo II strupov. Te raziskave bodo obsegale uporabo inovativnih na simulacijah temelječih računalniških pristopov načrtovanja in sledeče optimizacije katalitičnih inhibitorjev. V postopku rešetanja primernih spojin bomo preiskali širok kemijski prostor dostopnih spojin, spojin sintetiziranih na osnovi načrtovanja, kot tudi spojin naravnega izvora. Za izbrane kemijske razrede bodo izvedli obsežno in vitro encimsko, funkcionalno, biofizikalno karakterizacijo za identifikacijo spojin, ki bi bile primerne za nadaljnji predklinični razvoj do protirakavih zdravil. Spojine bomo ovrednotili tudi na nivoju delovanja na rakave celične linije.