Vpliv bakteriofaga na razvoj in larvicidno aktivnost bakterije Bacillus thuringiensis s parazitizmu podobno modulacijo

Bakterije plenijo bakteriofagi (fagi), ki, tako kot drugi virusi, izrabljajo gostiteljev nabor potrebnih encimov in gradnikov za svoje razmnoževanje. Vse bolj jasno je, da lahko fagi in bakterijske skupnosti pomembno vplivajo na svojega evkariontskega gostitelja. V tem projektu bomo raziskali, kako temperatni fag GIL01, ki okužuje sporulirajočo bakterijo Bacillus thuringiensis serovar israelensis, daje prednost lastnemu in bakterijskemu prenosu na druge trofične ravni. Omeniti velja, da je B. thuringiensis serovar israelensis najbolj razširjen naravni, nenevarni biopesticid v uporabi za zatiranje larv komarjev na svetu. Za raziskovanje povezave fag-bakterije-larve bomo za gostitelja faga uporabili entomopatogeni sev B. thuringiensis serovar israelensis T0131, ki je bil pred kratkim izoliran iz prsti v Braziliji. Ta izolat ne nosi profaga GIL01 (genoma GIL01). Sev T0131, ki nosi profag GIL01 smo pripravili v laboratoriju. V delovnem sklopu 1 bomo pokazali, da majhen, 50-aminokislinskih ostankov velik protein gp7, ki je ključnega pomena za pravilno vzpostavitev lizogenega stanja faga GIL01, ali druge determinante faga GIL01, povzročajo pomembne fenotipske spremembe pri gostitelju, sevu T0131. Izvedli bomo sporulacijske teste, teste za zaznavo bakteriofagov ter transkriptomske teste, da bi raziskali učinke determinant profaga GIL01 na povečano sintezo kristalnih toksinov, stopnjo sporulacije, viabilnost endospor in pakiranje profaga GIL01 v endospore. To je pomembno, ker lahko endospore omogočajo varen vstop GIL01 v telo žuželke in s tem povečajo prenos profaga GIL01, ujetega v endospore, na višjo trofično raven, v larve. Omeniti velja, da je dokazano, da žuželke zaužijejo endospore B. thuringiensis, ki nato kalijo v njihovih prebavilih. Naš cilj je tudi pokazati, da je profag GIL01, predvsem preko proteina gp7, sposoben preoblikovati transkriptomski profil gostitelja, kar poveča patogenezo B. thuringiensis T0131 pri larvah žuželk. Uveljaviti želimo koncept, da lahko profagi naravno izboljšajo bakterijski biopesticid. Preizkusili bomo vpliv GIL01/gp7 na pomembnega škodljivca, vinsko mušico (Drosophila suzukii) in velikega voščenega molja (Galleria mellonellla), modelno žuželko reda Lepidoptera, ki se rutinsko uporabljata za razvoj inovativnih biopesticidov. Za nas bo testiranje larvicidne aktivnosti izolata T0131 z ali brez profaga GIL01 na larvah komarja Aedes aegipty izvedlo podjetje BioGenious, Nemčija. Za rekonstrukcijo notranje anatomije in oceno poškodb srednjega črevesja ličink, bomo izvedli rentgensko računalniško tomografijo (mikro-CT) larv in vrstično elektronsko mikroskopijo notranje površine prebavnega trakta. Analizirali bomo nivo sporulacije izolata T0131 z ali brez profaga GIL01 tudi tekom rasti bakterije na kadavrih larv. V delovnem sklopu 2 bomo s konfokalno mikroskopijo, kvantitativnim PCR in proteomiko potrdili, da lahko fag GIL01 vstopi v citoplazmo insektnih celic. Prav tako želimo pokazati, da se gp7 in nekatere druge determinante, ki jih nosi profag GIL01, lahko prepišejo in sintetizirajo v insektni celici, kar bi vodilo do obsežnih sprememb v proteomski pokrajini celic žuželk. Tako bi pokazali, da lahko fag GIL01 neposredno vpliva na žuželko. V delovnem sklopu 3 želimo pokazati, da so se proteini, podobni gp7, razvili in delujejo kot dejavniki za prevzem bakterijskih procesov tudi v oddaljenih patogenih gram-negativnih bakterijah. Uporabili bomo transkriptomiko, spektrometrijo površinske plazmonske resonance in »cross-linking« z naknadno masno spektrometrijo za identifikacijo gp7 podobnih proteinov v bakterijskih družinah Vibrionaceae in Enterobacteriaceae, člani katerih so nekateri pomembni človeški patogeni. S tem bi dokazali, da se je v bakterijah odvila konvergentna evolucija gp7-podobnih proteinov.