Neinvazivni multi-omski biooznačevalci v podtipih imunskih celic za personalizirano zdravljenje otroške astme in molekularni mehanizmi neodzivnosti na inhalacijske kortikosteroide

Astma je najpogostejša otroška kronična bolezen in prizadene več kot 10% otroške populacije. Otroci se dobro odzivajo na standardno terapijo z inhalacijskimi kortikosteroidi (IKS), vendar obstaja velika variabilnost med posamezniki, saj ima velik delež otrok le delno nadzorovano bolezen, od katerih jih približno 10% trpi za hudimi simptomi kljub redni uporabi IKS, nekateri pa razvijejo tudi neželene učinke zdravila (NUZ). Globalna iniciativa za astmo (GINA) poskuša rešiti težave neučinkovite terapije z IKS in z IKS povzročenih NUZ z uvedbo novih smernic personaliziranega zdravljenja za kar je nujno potrebno odkriti biooznačevalce in razviti napovedne modele. Skupaj z našimi partnerji v mednarodnem konzorciju Pharmacogenomics in Childhood Asthma consortium (PiCA), smo pred kratkim smo izvedli asociacijsko študijo na celotnem genomu (GWA; Genome Wide Asssociation) pri več kot 3000 bolnikih z astmo, ki so prejemali inhalacijske kortikosteroide (IKS), in ugotovili več kandidatnih eno nukleotidnih polimorfizmov (SNPs; Single Nucleotide Polymorphisms) in genov, povezanih z odzivom na IKS, vključno z polimorfizmi SNP v bližini genov IL1RL1, CACNA2D3, WNT5A in ORMDL3, kot trenutno najbolj obetavnimi genetskimi biooznačevalci. Cilj predlagane raziskave je pojasniti molekularne mehanizme neodzivnosti na zdravljenje z IKS bolnikov z otroško astmo in odkritje biooznačevalcev za napoved odziva na IKS zdravljenje. Za dosego tega cilja bomo integrirali genomske (GWAs), ekspresijske (RNA-seq, qRT-PCR), proteomske, epigenomske (metilacija DNA) in regulatorne (profiliranje nekodirajočih RNA, alternativno izrezovanje intronov) podatke z bioinformatskimi orodji (genska ontologija – GO). V okviru mednarodnega konzorcija PiCa je naša slovenska kohorta bolnikov z blago in zmerno astmo (zdravljenje z GINA 2. korakom) edina, ki razpolaga z RNA za analizo genskega izražanja. Poleg tega je bila RNA izolirana iz naivnih bolnikov pred začetkom zdravljenja z IKS in nato po 4-6 tednih po zdravljenju, kar predstavlja v svetovnem merilu edinstveno biobanko, ki vsebuje vzorce DNK / RNA / proteina, izolirane od istih bolnikov pred in med zdravljenjem. Izvirnost predlagane študije je zagotovljena, saj bi bila to prva celovita transkriptomska analiza različnih tkiv z uporabo NGS (RNAseq) pred zdravljenjem z ICS v kombinaciji z drugimi podatki »omics«. Najbolj izviren del projekta predstavlja profiliranje imunskih celic v visoki ločljivosti in diferencialna analiza izražanja transkriptoma/proteoma/epigenoma (odzivniki proti neodzivnikom) v podtipih imunskih celic z uporabo 1. enoceličnega sekvenciranja RNA v vseh krvnih celicah; 2. Dekonvolucijska analiza podatkov RNAseq iz vseh krvnih celic; 3. Razvrščanje celic in RNAseq v najboljših kandidatnih podtipih celic. Najboljši kandidatni podtipi imunskih celic (začeli bomo s celicami CD8+ T in celicami ILC2) bodo izolirane iz odzivnih in neodzivnih bolnikov, gojene v funkcijskih celičnih modelih, stimulirane z za bolnika specifičnimi klinično dokazanimi alergenimi in tretirane s kortikosteroidi. Razvoj funkcionalnih celičnih modelov, ki posnemajo zdravljenje bolnikov in vivo, bomo uporabili za validacijo najboljših kandidatnih biomarkerjev (geni/beljakovine), ki jih bomo odkrili z multi-omsko analizo bolnikov (podatki in vivo) in z uporabo tehnike za manipulacijo izražanja ciljnega gena, kot je npr. CRISPR, pridobili globlje razumevanje signalnih poti in molekularnih mehanizmov, ki so vključeni v odziv na zdravljenje z IKS.V nasprotju z večino dosedanjih ekspresijskih študije na funkcionalnih celičnih modelih, ki so večinoma temeljile na tkivih, pridobljenih z obdukcijo pljuč, vključno z mišicami, pljučnim epitelijem in fibroblasti, se bo naša študija osredotočila na tkiva, kot so slina, bris sluznice nosu in kri, ki jih je možno pridobiti na relativno neinvaziven način in na osnovi teh raziskav odkriti biooznačevalci, ki jih bo možno uporabljati v klinični praksi za personalizirano zdravljenje otroške astme.