Nepravilnosti v translaciji, ki so podlaga za amiotrofično lateralno sklerozo in frontotemporalno demenco povezano z mutacijo v genu C9orf72

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) in frontotemporalna demenca (FTD) sta dve skrajni fenotipski manifestaciji progresivne nevrodegenerativne bolezni. Ena glavnih patoloških značilnosti obeh bolezni je prerazporeditev RNA-vezavnih proteinov iz jedra v citoplazmo, kjer tvorijo agregate. Pri približno 95 % bolnikov z ALS in 60 % bolnikov s FTD se v citoplazmi kopičijo agregati, ki jih sestavlja protein TDP-43, zato take bolezni pogosto imenujemo tudi proteinopatije TDP-43. Le za majhen delež teh agregatov so odgovorne mutacije v genu, ki nosi zapisza TDP-43. Zato se raziskave o vzrokih za razvoj ALS in FTD obolenj ter iskanju novih zdravil zanju, usmerjajo tudi v odkrivanje mehanizmov nastanka agregatov ne-mutiranega TDP-43. Prerazporejanje slednjega namreč lahko povzročajo tudi mutacije v drugih genih, povezanih s TDP-43 proteinopatijo, med katerimi je najpogostejša mutacija heksanukleotidnih ponovitev (HRE) GGGGCC ((G4C2)n) v genu C9orf72. Natančen mehanizem, ki bi pojasnil vpliv mutacije HRE na agregacijo TDP-43, še vedno ni znan. Predvidevamo, da mutacija povzroča nevrodegenerativne spremembe preko treh mehanizmov, ki vključujejo: haploinsuficienco, toksičnost (G4C2)n ter (C4G2)n RNA in toksičnost prevedenih dipeptidnih ponovitev. Pri raziskavah toksičnosti RNA smo tudi mi, poleg drugih, identificirali in poročali o številnih RNA-vezavnih proteinih (RBP-jih), ki se in vitro vežejo na (G4C2)n RNA, kolokalizirajo z jedrnimi agregati (G4C2)n, imenovanimi RNA-fociji in se v transficiranih celicah ter C9ORF72-pozitivnih celicah možganov združujejo v ribonukleoproteinske (RNP) komplekse. Veliko manj pa je znanega o patomehanizmih protismiselnega zaporedja (C4G2)n RNA, čeprav ta bolje korelira s patologijo TDP-43. V sklopu priprav na projekt smo izvedli preliminarne poskuse in opazili zelo močno vezavo (C4G2)32 RNA s fenilalanin-tRNA sintetazo (FARS). Prva raven funkcionalne analize je pokazala, da (C4G2)32 RNA in vitro inhibira delovanje FARS encima, signifikantno pa se tudi zmanjša populacija vezane tRNA s Phe v C9orf72-mutiranih limfoblastih. V teh celicah smo nato opazili tudi zmanjšano izražanje s fenilalaninom-bogatih proteinov. Ta zanimiv niz eksperimentov tako pritrjuje hipotezi otranslacijskih nepravilnostih kot zelo verjetnem mehanizmu za razvoj bolezni povezanih s HRE mutacijo v C9orf72 genu. Cilj predlaganega projekta je določiti, pomen in terapevtski potencial translacijskih nepravilnosti, ki jih povzroča mutacija v C90rf72 genu za nevrodegenerativna obolenja. Glavni cilji so: 1) Karakterizacija inhibicije FARS z (C4G2)n RNA. 2) Določiti vpliv zmanjšanja populacije vezane tRNAPhe. 3) Ovrednotiti pomen odkrite translacijske nepravilnosti za bolezen. 4) Ustvariti področje novih terapevtskih pristopov za omilitev translacijskih nepravilnosti. Zastavljene cilje nameravamo doseči z uporabo najbolj naprednih metod, kot so sekvenciranje vezanih tRNA, ribosomsko profiliranje, 'klik' kemija, analiza makromolekulskih interakcij, in vrhunske bioinformatske metode, s katerimi razpolagamo s sodelujočimi institucijami. Skupaj z izvedbo validacije v novih bolezenskih modelih in tkivih pacientov bodo naši rezultati omogočili globlji vpogled v ključne molekulske procese v celicah, povezane z nevrodegeneracijo, in omogočili razvoj potencialnih novih zdravil. Tako vodja projekta kot nacionalni in mednarodni sodelavci imamo bogate izkušnje z določanjem interakcij med proteini in RNA, izražanjem RNA, obdelovanjem velikega števila podatkov, molekularnimi mehanizmi in modeliranjem ALS ter FTD obolenj. Zelo dober izhodiščni položaj za izvedbo in uspešen zaključek raziskav, ki so predstavljeni v tem predlogu, nam zagotovo dajejo tudi izkušnje pri razvoju novih pristopov in tehnik, kar dokazujemo z znanstvenimi objavami v najvplivnejših revijah.