Strukturne raziskave izjemnega večopravilnega proteina 'Helper Component Proteinase' iz rastlinskih virusov

Na svetovni ravni rastlinski škodljivci in patogeni povzročijo 40 % izgube pridelka letno. Med rastlinskimi patogeni so virusi odgovorni za skoraj polovico rastlinskih endemičnih infekcij. Potyvirusi (rod Potyvirus, družina Potyviridae) predstavljajo največjo skupino znanih rastlinskih RNA-virusov. Tipska vrsta, krompirjev virus Y (PVY), je gospodarsko najpomembnejši virus, ki močno škoduje pridelavi krompirja in drugih razhudnikov po vsem svetu. Potyvirusni virioni so fleksibilni filamentozni delci z 10 kb dolgim genomom, ki je enoverižna RNA. Kot je značilno za RNA-viruse, omejitev velikosti genoma povzroči ekononomično porazdelitev funkcij znotraj majhnega števila večopravilnih proteinov z večdomensko strukturo in intrinzično neurejenimi regijami, da se omogoči promiskuitetnost vezave in funkcionalna raznolikost. Med enajstimi potivirusnimi proteini, ki se sproščajo iz virusnega poliproteina po translaciji, po svojih izjemnih večopravilnih sposobnostih izstopata pomožna komponenta-proteinaza (HCPro) in plaščni protein (CP). HCPro je ključen za prenos virionov z listnimi uši, kateri je glavni način prenosa potivirusov z rastline na rastlino. HCPro deluje tudi pri zorenju virusnih poliproteinov, razmnoževanju virusa, kopičenju virusa, gibanju od celice do celico in sistemskem gibanju, intenzivnosti simptomov in povečanju donosa virusnih delcev. HCPro veže tudi nukleinske kisline, kot so majhne eno- in dvoverižne RNA, zaradi česar je bistven dejavnik pri zaviranju utišanja RNA, s čimer kljubuje protivirusnemu imunskemu odzivu rastlin. CP je edini virusni strukturni protein in gradi virusne delce, vključen pa je tudi v prenos virionov preko listnih uši, gibanje od celice do celice in sistemsko gibanje ter replikacijo genoma. Interakcije med HCPro in CP so bile opisane pri virusih, ki se prenašajo preko listnih uši in tudi pri tistih, ki se ne, kar kaže da te interakcije presegajo zgolj prenos virionov z listnimi ušmi. V predlagani raziskavi bomo obravnavali molekularne mehanizme virusnega prenosa z listnimi ušmi in zaviranja protivirusne odpornosti rastlin z uporabo integriranih pristopov molekularne in strukturne biologije. Glavni cilj je strukturno in mehanistično opisati večnamenski protein HCPro. Pripravili bomo rekombinantni HCPro (različne oblike, kot so fuzijski proteini in mutanti) in določili njegovo tridimenzionalno strukturo. Za vpogled v mehanizem delovanja bomo nato z biokemijskimi in biofizikalnimi pristopi proučili interakcije HCPro (in variant) z izbranimi vezavnimi partnerji, torej različnimi oblikami CP in majhnimi RNA, ter določili tridimenzionalne strukture izbranih kompleksov HCPro s CP ali s sRNA. Primerjali bomo interakcije med sorodnimi pari HCPro/CP virusnih izolatov listnih uši, ki se in ki se ne prenašajo preko listnih uši. Proteinska zaporedja HCPro in CP bodo izvirala iz potivirusov PVY in krompirjevega virusa A (PVA). Ves čas projekta bomo tesno sodelovali s strokovnimi rastlinskimi virologi. Pričakujemo, da bodo rezultati naše raziskave pomembno prispevali k razumevanju potivirusne biologije in rastlinske obrambe. Poznavanje strukturne in mehanistične osnove vezave kofaktorjev na HCPro bo prispevalo k boljšemu razumevanju procesov, kot so prenos virusov z listnimi ušmi in virusna obramba pred imunskim sistemom rastlin. Rezultati bodo tudi aplikativne narave. 3D struktura HCPro bo namreč omogočila vpogled v to, kako je mogoče v majhnem volumnu posameznega proteina izvajati različne ali celo neodvisne funkcije, s čimer bo zagotovila molekularno platformo za sintezne biologe za pripravo (umetnih) večopravilnih proteinov za uporabo v biotehnologiji. Poleg tega se virusni strukturni proteini, kot je CP in njihove in vitro pripravljene različice v bakterijskem ekspresijskem sistemu (kot načrtovano v tej študiji), lahko uporabijo za pripravo virusom podobnih delcev s potencialno uporabo v medicini, dostavi zdravil, razvoju cepiv ali sintezi hibridnih (nano)materialov.