Mikrofluidična mehanoporacija za celično terapijo

Napredne terapevtske metode, kot je imunoterapija proti raku s CAR-T celicami, se vse bolj zanašajo na gensko modifikacijo bolnikovih avtolognih celic, čemur sledi njihova ex-vivo ekspanzija in ponovna infuzija nazaj v bolnika. Dober nadzor nad manipulacijo celic med terapijo in upoštevanje najvišjih standardov dobre proizvodne prakse sta zato pri tem postopku izjemnega pomena. Konvencionalne metode za celično terapijo, kot je virusni prenos genov, transfekcija z elektroporacijo ali lipofekcija, vplivajo hkrati na mnogo celic v raztopini, kar ne more zagotoviti enakih pogojev transfekcije za vse celice, posledica česar pa je omejena sposobnost preživetja celic, slaba učinkovitost in neenakomirnost transfekcije. Poleg tega so te metode pogosto tehnično zahtevne, delovno intenzivne in porabijo veliko dragih reagentov. Za premagovanje teh omejitev je bilo predlaganih več mikrofluidičnih pristopov za zagotovitev enakih pogojev transfekcije na ravni posamezne celice. Eden od teh obetavnih pristopov temelji na mikrofluidnični mehanoporaciji, pri kateri se genetski material vnese v celico skozi membranske pore, ki jih ustvarijo mehanske sile v mikrofluidničnem sistemu, na primer s stiskanjem celic skozi ozke kanale. Preden pa se mehanoporacija lahko sprejme za celično terapijo, je treba razrešiti več tehnoloških in temeljnih vprašanj. Na primer, osnovni mehanizmi mehanoporacije niso v celoti razumljeni in njeni biološki učinki na imunske celice še niso raziskani. V tem projektu bomo razvili inovativen mikrofluidični sistem za učinkovito mehanoporacijo in transfekcijo imunskih celic, ki bo razrešil nekatere pomembnejše probleme konvencionalnih metod. Sistem bo združeval mehanoporacijo z optično vizualizacijo celic v realnem času in deformabilnostno citometrijo. Zasnovan bo za robustno delovanje ter učinkovito in natančno dostavo reagenta do celic. S pomočjo sistema bomo lahko odgovorili na nekaj temeljnih odprtih vprašanj, na primer, kako stanje celice (npr. velikost, deformabilnost, lastnosti celične membrane in citoskeleta) in eksperimentalni parametri (npr. temperatura, strižna napetost) vplivajo na učinkovitost in sposobnost preživetja transfekcije; kako velike so pore v membrani; koliko plazmidov mora vstopiti v celico za uspešno transfekcijo itd. Po poraciji ne bomo testirali le sposobnosti preživetja celic, temveč tudi njihovo fiziološko sposobnost in hitrost okrevanja. Razumevanje mehanizmov, ki stojijo za mehanoporacijo, bo bistveno pospešilo optimizacijo eksperimentalnih parametrov za učinkovito transfekcijo imunskih celic, s čimer se bo metoda približala klinični uporabi. Poleg tega bodo povratne informacije o stanju celic v realnem času ključnega pomena pri upoštevanju dobrih proizvodnih praks v prihodnosti. Za dosego predlaganega cilja bo v projektu sodelovala interdisciplinarna ekipa raziskovalcev iz treh skupin z dopolnjujočim se strokovnim znanjem. Biofizikalni del bo izvajal Inštitut za biofiziko Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani, ki ga sestavljajo strokovnjaki za teoretično in eksperimentalno biofiziko celične mehanike, ki so nedavno razvili novo metodo za ocenjevanje trdote celic z optično pinceto in imajo vse potrebno znanje in izkušnje za manipulacijo posameznih celic v mikrofluidičnih sistemih. Naloge s celično genetsko manipulacijo bo izvajal Oddelek za sintezno biologijo in imunologijo Kemijskega inštituta v Ljubljani, ki ima izjemne izkušnje na področju različnih aplikacij sintezne biologije, genskega inženiringa in imunologije. Zasnova in izdelava mikrofluidičnih naprav bo temeljila na strokovnih izkušnjah Centra COMPETE na Univerzi v Ljubljani, ki je multidisciplinarno središče za mikrofluidične tehnologije, financirano iz sheme EU Widespread. Vzpostavljena infrastruktura COMPETE bo uporabljena tudi za podajanje mikrofluidične tehnologije javnosti, industriji in kliničnim uporabnikom.