Uporaba izboljšanega sistema CRISPR/Cas za nevirusno produkcijo celic CAR-T

Celice CAR-T s svojo sposobnostjo od MHC neodvisnim prepoznavanjem površinskih rakavih celičnih markerjev, predstavljajo revolucionarni način terapije različnih rakavih obolenj. Prepoznava površinskih celičnih rakavih markerjev preko himernega antigenskega receptorja (CAR) vodi v aktivacijo celic, produkcijo citokinov in posledično uničenje rakavih celic. Velik uspeh celic CAR-T v terapiji CD19 malignih obolenj je vodil v odobritev zdravila s strani FDA. V glavnem poteka produkcija celic CAR-T z eksterno modifikacijo pacientovih avtolognih celic T, ki se jih virusno modificira z namenom stabilnega izražanja receptorja CAR za dolgotrajno terapevtsko učinkovitost celic. Glavno slabost virusne produkcije celic CAR-T predstavlja možnost naključne integracije virusne informacije, kar lahko vodi v insercijsko mutagenezo, če naključno vgrajene virusno posredovane informacije rušijo normalen genotip celic. Le-to lahko vodi v rakave spremembe in različne nepravilnosti, prav tako je končni celični produkt manj homogen, fenotip je prav tako suboptimalen. V izogib slednjemu je zaželena mestno-specifična tarčna insercija, kar se lahko doseže z uporabo sistema CRISPR/Cas. Slednji modificira celice s tarčno integracijo CAR konstrukta, ki se ga celicam posreduje preko DNA matrice, ki jo celice uporabijo pri HDR samo-popravljalnemu mehanizmu popravilu DNA dvojno-verižnih prelomov. Učinkovitost popravila HDR je zelo nizka, zato so nujne izboljšave načinov produkcije celic CAR-T z uporabo sistema CRISPR/Cas. V predlaganem projektu želimo uporabiti naš izboljšan sistem CRISPR/Cas, ki se je izkazal za zelo učinkovitega pri modifikacijah genoma, za produkcijo celic CAR-T na ne-virusni način, torej z namenom izogib stranskim učinkom virusne priprave celic CAR-T. Izboljšan sistem CRISPR/Cas (CCExo) temelji na paru heterodimernih peptidov, ki tvorijo obvite vijačnice. Določen peptid para je povezan s proteinom Cas9, drug par peptida, ki tvori obvito vijačnico pa je povezan z eksonukleazo. Nastanek obvite vijačnice tako pripelje eksonukleazo v bližino DNA dvojno-verižnega preloma. Eksonukleaza na mestu preloma dodatno cepi DNA konce, tako da ustvari komplementarne enoverižne konce DNA. Enak proces dodatne cepitve DNA koncev poteče tudi na DNA matrici, ki nosi zapis za želeni transgen. Proces cepitve DNA koncev na genomu in DNA matrici tako vodi v nastanek komplementarnih DNA koncev, kar omogoči lažjo tarčno vstavitev transgena in končni višji odstotek celic CAR-T. Dodatne izboljšave, ki se jih predlaga je tudi uporaba gRNA, ki nosi zapis za streptavidin-vezalno apatamero ter prisotnost biotinilirane DNA matrice. Z ne-virusnim načinom (elektroporacija, uporaba lipidnih nanodelcev-LNP) produkcije celic CAR-T želimo doseči večji odstotek celic CAR-T z bolj definiranim fenotipom in imunoterapevtskimi lastnostmi v primerjavi z virusno produkcijo celic CAR-T. Z uporabo streptavidin-apatamerno gRNA in biotinilirano DNA matrico želimo povečati transport DNA matrice v jedro z namenom večje tarčne integracije želenega transgena. Funkcionalnost tako pripravljenih celic CAR-T želimo preveriti tudi na mišjih rakavih modelih. Omenjen projekt je prvi, ki ponuja sistematično primerjavo virusne in ne-virusne produkcije celic CAR-T, kar dodatno dviguje vrednost ne-virusne produkcije celic z uporabo sistema CRISPR/Cas. Omenjena tehnika z višjo učinkovitostjo proizvodnje se lahko tako uporablja ne le za produkcijo celic CAR-T, ampak tudi za druge genske terapije. Prepričani smo, da bo mesto-specifična tarčna integracija postala nov zlati standard v produkciji terapevtskih celic.