Razvoj in vpeljava Crispr/Cas diagnostike za terensko detekcijo viroida razpokanosti skorje agrumov (CBCVd) v hmelju (Humulus lupulus L.)

V zadnjih 40 letih so svet pretresle številne epidemije, ki so jih povzročili virusi kot je HIV, SARS, H1N1, Ebola, Zika in med zadnjimi SARS-CoV-2, vsem znana kot povzročitelj bolezni COVID-19. V vseh primerih je odziv javnega zdravstva na prisotno virusno grožnjo oviralo pomanjkanje hitrega, dostopnega in zanesljivega molekularnega diagnostičnega testiranja. Kljub temu, da živimo v zelo raziti družbi, ki je ustvarila številne tehnološke čudeže, hitro in natančno določanje patogenov še vedno predstavlja kritično točko tako v humani kot v rastlinski virologiji. Velik potencial v rastlinski diagnostiki predstavlja uporaba CRISPR sistema, zaradi velike občutljivosti, specifičnosti, hitrosti, fleksibilnosti, robustnosti in preproste uporabe. CRISPR v kombinaciji z RT-RPA in hitrimi testi omogoča hitro določanje, ki je primerno tudi za uporabo na terenu. Glavni cilj projekta je razviti metodo CRISPR/Cas-RT-RPA za določanje viroida CBCVd, ki bo bistveno skrajšala čas analize hkrati pa bo občutljiva, cenovno ugodna in primerna za številne aplikacije, med katerimi bo najpomembnejša možnost uporabe na terenu. Viroid CBCVd povzroča neozdravljivo bolezen hudo viroidno zakrnelost hmelja, ki je v obdobju 2007–2020 v Sloveniji prizadela skoraj 500 ha hmeljišč (od 1500 ha), kljub izkrčenju več kot 330 ha, izvajanju ukrepov in nadzoru pa se še danes širi na nove nasade. Trenutno je v rutinski uporabi RT-PCR, ki ne omogoča odkrivanja latentnih okužb, zato obstaja potreba po hitri in občutljivi metodi. V predhodnih raziskavah smo razvili občutljive molekularne metode, ki omogočajo sočasno določanje in kvantifikacijo, ampak ne omogočajo fleksibilnega in hitrega določanja. Razvoj novih metod je nujen korak k odkrivanju novih žarišč in zajezitvi širjenja, kar naše ekspertize najbolj zaobjamejo. V okviru projekta bomo razvili tri metode: RT-RPA (P1), CRISPR/Cas (P2) in CRISPR/Cas-RT-RPA (P3), katerih uporabo bomo prilagajali glede na potrebe analiz. Kot prvo bomo razvili RT-RPA, ki nam bo služila za namnožitev viroida, hkrati bomo optimizirali detekcijo, da jo bomo lahko uporabljali tudi kot samostojno metodo z manjšo občutljivostjo (P1). V okviru P1 bomo načrtovali in testirali začetne oligonukleotide, primerjali različne komplete reagentov in optimizirali reakcijo. V drugem delu projekta (P2) bomo razvili CRISPR/Cas sistem, načrtovali in testirali bomo več crRNA molekul, ssDNA sond in primerjali Cas proteine. Metodo bomo optimizirali brez predhodnega pomnoževanja, da bo lahko uporabna tudi kot samostojni CRISPR/Cas sistem. Glavni del projekta bo optimizacija CRISPR/Cas-RT-RPA pri kateri bomo obe razviti metodi združili v eno (P3). Pomemben cilj projekta bo tudi razvoj metode za pripravo rastlinskih ekstraktov (hitra »izolacija«) (P4). S testiranjem in optimizacijo različnih pufrov in načinov za homogenizacijo rastlinskega tkiva bomo lahko viroid CBCVd določili s CRISPR/Cas-RT-RPA brez izolacije RNA. V okviru P4 bomo testirali hitre teste (LFA), ki bodo omogočili hitro določanje viroida CBCVd tako v laboratoriju kot na terenu. Z uporabo vseh izboljšav pričakujemo, da bomo čas analize iz 2 dni, ki jih potrebujemo za RT-PCR, skrajšali na 1 uro. Razvito metodo bomo zato vpeljali za uporabo na terenu, hitro odkrivanje novih žarišč in testiranje certificiranih sadik hmelja. Da bomo metodo CRISPR/Cas-RT-RPA lahko uporabljali za rutinska testiranja jo bomo ustrezno validirali (P5). Razvoj metode, ki bo omogočala hitro določanje, brez predhodne izolacije RNA, hkrati pa bila občutljiva in primerna za uporabo na terenu, bo pomenil velik napredek pri raziskavah hmelja, kot rastlinski diagnostiki nasploh. Metoda bo uporabna za hitra odkrivanja novih žarišč, testiranjih sadilnega materiala, vrednotenju odpornosti sort in epidemiološke študije. To bo omejilo nadaljnje širjenje bolezni in ublažilo ekonomsko škodo v hmeljarstvu.