Inducibilno Programiranje Intrinzičnih Lastnosti Celic CAR T za Imunoterapijo Raka

CAR (»Chimeric Antigen Receptor«) T-celična imunoterapija je klinično-odobren pristop zdravljenja raka z uporabo gensko spremenjenih avtolognih (bolniku lastnih) celic T. Čeprav je CAR T-celična imunoterapija spremenila paradigmo zdravljenja določenih vrst raka, pa ni vedno uspešna, kar je razvidno iz pogoste neodzivnosti ali ponovitve bolezni. Učinkovitost CAR T-celične imunoterapije je omejena pri čvrstih tumorjih in krvnih rakih, ki inducirajo nefunkcionalne fenotipe celic T. Poleg tega pri precejšnjem številu bolnikov, ki potrebujejo CD19 CAR T terapijo, nefunkcionalne celice T preprečujejo uspešno proizvodnjo celičnega produkta. Genetska integracija ustreznih pomožnih molekul v celice CAR T je obetaven pristop k izboljšanju funkcij celic T in izidu terapije. Vendar ostajajo vrzeli tako v znanju kot translaciji v zvezi z (i) razumevanjem, katere pomožne molekule bodo zagotovile optimalno terapevtsko učinkovitost, če bodo prekomerno izražene v celicah CAR T, in (ii) kako jih na klinično izvedljiv način genetsko vključiti v celice CAR T. Moj predlog je namenjen reševanju teh izzivov za izboljšanje celic CAR T, usmerjenih na CD19 pozitivne hematološke maligne bolezni. To bomo dosegli z (i) vključitvijo ključnih transkripcijskih faktorjev (TF), ki smo jih identificirali v predhodnih študijah kot pomembne kandidate za izboljšanje intrinzičnih lastnosti T celic in (ii) njihovo genetsko integracijo v celice CAR T za inducibilno izražanje (iTF-CAR T celice). V Cilju 1 bomo uporabili novo gensko platformo imenovano Uni-Vect, ki sem jo razvil na Univerzi v Pensilvaniji (UPenn). Uni-Vect bo omogočil prehodno izražanje TF v celicah CAR T, preizkusili bomo pa tudi konstitutivno izražene TF (cTF-CAR T celice). Ustvarili bomo celice CAR T usmerjene na CD19, nadgrajene z ektopično ekspresijo dveh ključnih transkripcijskih faktorjev in njunih različic in na ta način ustvarili celice CAR T s fitnes profilom, povezanim s sposobnostjo delitve, obstojnosti in posredovanja regresije raka po infuziji. Pristop i/cTF-CAR T celic bomo nadalje optimizirali z uporabo enostopenjskega pristopa ciljne integracije genov z uporabo sistema CRISPR/Cas9, kar bo hkrati izboljšalo varnost in proizvodnjo i/cTF-CAR T celic. V Cilju 2 bomo razvili celovite in vitro sisteme za ovrednotenje in primerjavo funkcionalnih in fenotipskih lastnosti i/cTF-CAR T celic. Z uporabo naprednih imunoloških metod, vključno s celovito analizo i/cTF-CAR T celic z uporabo RNA sekveniranja, bomo preučili mehanizme, ki vodijo do izboljšanih funkcij. Raziskali bomo tudi, ali lahko i/cTF-CAR T celice izboljšajo aktivnost proti celicam primarne kronične limfocitne levkemije (CLL) izoliranih iz bolnikov, ki se zdravijo s CART19 na UPenn, in izboljšajo proizvodnjo celic T, kjer je neučinkovita delitev omejitveni faktor za proizvodnjo celičnega produkta. Cilj 3 je namenjen testiranju i/cTF-CAR T celic tako v ksenotransplantacijskih kot tudi v genetsko in imunološko kompatibilnih predkliničnih mišjih modelih. Raziskali bomo vpliv ektopične ekspresije različic TFs na delitev, obstojnost in protitumorsko delovanje celic CAR T in vivo. Nato bomo izvedli celostno analizo celic CAR T, izoliranih iz miši, ter preučili njihov fenotip, izražanje genov in delovanje, da bomo bolje razumeli, kateri so ključni dejavniki, ki prispevajo k izboljšanju intrinzičnih lastnosti. To bo omogočilo nova znanja in usmeritve za nadaljnji razvoj i/cTF-CAR T celic. Krovni cilj projekta je torej razviti i/cTF-CAR T celice, genetsko opremljene za izboljšano delitev, obstojnost in protitumorsko delovanje ter izboljšati proizvodnjo celic CAR. Poleg tega bomo raziskali mehanizme, s katerimi TF-ji lahko izboljšajo terapevtsko učinkovitost celic CAR T, in s tem novim razumevanjem biologije celic CAR T postavili temelje za razvoj učinkovitejših celičnih imunoterapij.