Ciljana mutageneza s CRISPR/CAS9 za odpornost vinske trte in krompirja proti fitoplazmam

Vinska trta (Vitis vinifera L.) je pomembna lesna sadna vrsta po vsem svetu. V letu 2017 je proizvodnja grozdja znašala več kot 74 milijonov ton, od katerih je bila približno tretjina proizvedena v Evropi. To uvršča proizvodnjo grozdja na sedmo mesto v proizvodnji kmetijskih pridelkov v Evropi (http://www.fao.org). Ta pomembni ekonomski sektor ogrožajo številne bolezni vinske trte, ki jih povzročajo virusi, bakterije, oomicete, glive in žuželke. Patogeni proizvodnjo ogrožajo v času pred in po obiranju grozdja, med procesiranjem in izvozom, vplivajo pa tudi na kakovost pridelka. Med najbolj razširjenimi in problematičnimi boleznimi vinske trte sta zlata trsna rumenico, ki jo povzroča fitopatogena bakterija fitoplazma FD in navadna trsna rumenica, ki jo povzroča fitoplazma ‘Candidatus Phytoplasma solani’. Slednja prav tako okužuje rastline iz družine razhudnikovk, kjer na krompirju in paradižniku že povzroča velike težave v sosednjih državah, vključno z Avstrijo. V Južni Afriki glavno fitoplazemsko bolezen vinske trte z enakimi bolezenskimi znamenji kot pri navadni in zlati trsni rumenici povzroča 'Ca. P. asteris’. Za enkrat ne poznamo sort vinske trte ali krompirja, ki bi bile odporne proti fitoplazmam. Kljub temu so že opazili med sortami razlike v občutljivosti na osnovi incidence bolezni, resnosti bolezenskih znamenj in sposobnosti rastline, da okreva. Ker trenutno ni na voljo nobeno učinkovito sredstvo ali agronomska praksa za zaščito vinske trte in krompirja pred fitoplazmami, je izjemno pomembno pridobiti odporne/tolerantne sorte. Nove strategije za zaščito rastlin pred patogeni vključujejo izničenje funkcije rastlinskega gena za občutljivost S. Geni S so vključeni v kompatibilno interakcijo in so nujni za okužbo. Njihova deaktivacija lahko omeji sposobnost patogena, da povzroči bolezen. Naša transkriptomska analiza vinske trte, okužene s fitoplazmo, nakazuje možno negativno vlogo gena DMR6 (downy mildew resistance 6) pri rastlinski obrambi.Ta je bila že pokazana tudi pri krompirju in paradižniku. DMR6 kodira oksidoreduktazo (2-oksoglutarat (2OG)-Fe(II) oksigenazo) in je funkcionalno 5-hidrolaza salicilne kisline (S5H). Zdi se obetaven kandidat med geni S za ciljano mutagenezo z dobrimi obeti, da bi njegova deaktivacija povečala odpornost proti fitoplazmam in možno tudi proti drugim patogenom. Glavni cilj predlaganega projekta je izboljšati odpornost vinske trte in krompirja proti fitoplazmam po izbitju gena DMR6 s sistemom CRISPR/Cas9. Vzporedno bomo transkriptomske podatke o s fitoplazmami okuženi vinski trti, ki smo jih pridobili v prejšnjih raziskavah v Sloveniji, Avstriji in Južni Afriki, povezali z računalniško obdelavo in modeliranjem. Na ta način bomo poskušali določiti nekatere nove kandidate za občutljivostne gene S, ki bi jih, poleg DMR6, lahko uporabili kot tarče za povečano odpornost vinske trte proti fitoplazmam. Predlagamo prilagoditev genetskega urejanja protoplastov vinske trte brez DNA, z uporabo neposrednega vnosa prečiščenih CRISPR/Cas9 ribonukleoproteinov s ciljanjem tarčnega gena v rastlini. Na regeneriranih rastlinah bomo proučevali učinke transformacije na fenotip in splošno gensko izražanje. Predlagani pristop mutageneze ima boljše možnosti, da bi bile rastline, ustvarjene z njim, sprejete na globalni ravni. Kot alternativo bomo uporabili metodo vnosa genetskega materiala z nanodelci in/ali izbijanje tarčnega gena s tranformacijo z agrobakterijo s postopki, ki je že uveljavljen v predlaganih partnerskih laboratorijih. Za testiranje pridobljene odpornosti proti fitoplazmam, bomo vse regenerirane rastline krompirja in vinske trte inokulirali s proučevanimi fitoplazmami. Potrditev povezave izbitega tarčnega gena s povečano odpornostjo/toleranco na fitoplazme, bo odprla številne nove možnosti v raziskavah pomembnega področja rastlinskega imunskega sistema, z možnostjo pridobitve novih izboljšanih sort vinske trte in krompirja.